Barthold Kuijken groeide op in Brugge, waar hij ook zijn eerste muzieklessen kreeg aan het Stedelijk Conservatorium. Hij zette zijn fluitstudies verder aan de Koninklijke Conservatoria van Brussel en Den Haag (waar hij sinds 1977 zelf lesgeeft). Parallel met deze "officiële" opleiding ontwikkelde zich een sterke interesse voor oude muziek en de uitvoeringspraktijk daarvan op originele instrumenten. Als autodidact specialiseerde hij zich op de traverso; zijn leidraden waren de 18de-eeuwse fluitmethodes, handboeken over uitvoeringspraktijk en de oude instrumenten zelf, bewaard in musea en privé-collecties. Daarnaast (en tegengesteld hieraan) was hij ook geruime tijd actief in de avantgardemuziek. Zo speelt hij hedendaagse muziek op de moderne dwarsfluit in het Ensemble Musique Nouvelles.

Als solist is hij actief in kamermuziekensembles met andere specialisten op het gebied van de oude muziek (zijn broers Sigiswald en Wieland, Robert Kohnen, Gustav Leonhardt, Bob van Asperen, Ewald Demeyere, Luc Devos…), als fluitist in verschillende barokorkesten. Hij was lid van het Parnassus Ensemble, het Collegium Aurem en La Petite Bande.

Barthold Kuijken concerteert over de hele wereld. Hij wordt regelmatig gevraagd voor masterclasses en als jurylid van internationale wedstrijden.

Hij was docent aan de Conservatoria van Brussel en Den Haag. In 2007 behaalde musicus Barthold Kuijken als eerste in Vlaanderen een Doctoraat in de muziek (VUB) met de volgende studie:"The notation is not the Music - Reflections on more than 40 years' intensive pratice of Early Music".

Als dirigent is hij actief sinds 1986. Toen vroeg Octophorus hem het blaasoctet van Mozart en de Gran Partita te dirigeren tijdens het Musica Antiqua Festival te Brugge en voor de aansluitende opname op het label accent. Sindsdien leidt hij regelmatig orkesten als The Orchestra of the Age of Enlightenment London, L'Arpa Festante (Munchen), Accademia Montis Regalis (Mondovi), Arion (Montréal), Queensland Philharmonic Orchestra (Brisbane), Concerto Armonico (Budapest), Mitteleuropaïscher' Chor und Orchester (Roveretto), Il Fondamento (Brussels), Les Folies françaises (Paris), Arte dei Suonatori (Poznan), I musici di Santa Pelagia (Turijn), Ensemble baroque du Léman (Lausanne). Vanaf 2002 werkt hij vaak met het Indianapolis Baroque Orchestra waar hij eerst artistiek directeur werd en aansluitend vanaf 2008  vaste dirigent.

Daarnaast begeleidt hij vaak Vroege Muziek projecten in de grote Europese Consevatoria als Brussel, Amsterdam, Den Haag, Frankfurt, Genève en Musica te Peer.

Barthold Kuijkens repertoire gaat van Lully tot Beethoven, met het accent op de Franse orkestsuite (Lully, Marais, Rameau, Leclair, Telemann), het repertoire van de Deutsche Empsindsamkeit (C.P.E.Bach, Benda), de Bach familie en het Weense classicisme. Hij werkt vaak samen met zangers en treedt occasioneel op als fluitsolist tijdens een fluitconcerto in één van zijn vele programma's.

Sinds september 2014 is Barthold Kuijken met pensioen.